文献名：Ginsenoside Rg1 alleviates acute liver injury through the induction of autophagy and suppressing NF-κB/NLRP3 inflammasome signaling pathway.DOI：10.7150/ijms.50919若需PDF原文，可联系笔者（微信/电话：17680315139）
01试验背景
急性肝损伤时，肝细胞会大量凋亡并伴随出血性坏死，严重导致肝功能衰竭。自噬，是细胞内的一项重要机制，能帮助细胞自我降解损伤的部分，并回收重要的分子，是细胞保持稳态和健康的关键过程，因此能反映细胞的损伤修复功能。通过调控细胞自噬能缓解急性肝损伤（自噬是一种高度保守的分解代谢过程，可以在能量或营养不足的情况下防止细胞损伤，促进细胞存活，并对各种细胞毒性损伤做出反应）。前期研究发现人参皂苷Rg1（G-Rg1）在急性肝损伤的动物模型中具有改善肝功能和抑制Caspase依赖性的肝细胞凋亡的能力。基于此，本文作者提出人参皂苷Rg1可能通过调节自噬途径在急性肝损伤中发挥保护作用，并通过本试验进行验证。
02 试验过程及结果
01人参皂苷Rg1对急性肝损伤动物的保肝作用
为了研究人参皂苷Rg1在急性肝损伤中的作用，我们在注射CCl4 24h后检测动物血清中谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、TNF-α、IL-1β、IL-6的水平(图1A)。G-Rg1治疗组ALT、AST、TNF-α、IL-1β、IL-6水平较对照组显著降低，提示人参皂苷Rg1治疗具有改善肝功能、抑制炎症反应的能力。此外，自噬激动剂RPA联合人参皂苷Rg1与人参皂苷Rg1治疗组相比，ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6显著降低。与人参皂苷Rg1组相比，添加自噬抑制剂3-MA组ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6均升高。HE染色也显示人参皂苷Rg1对CCl4诱导的急性肝损伤动物具有较强的肝保护作用(图1B)。
上述结果提示自噬在人参皂苷Rg1对急性肝损伤的保护作用中发挥重要作用。图1 人参皂苷Rg1对急性肝损伤动物的保肝作用A:对照组、G-Rg1(4mg/ml)对照组、G-Rg1(4mg/ml) + RPA(1mg/kg)组和G-Rg1(4mg/ml) + 3-MA (1mg/kg)组注射CCl4 24 h后测定血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β、IL-6 。B: HE染色，Ⅰ:正常肝组织，Ⅱ:CCL4组，Ⅲ:G-Rg1组，Ⅳ:G-Rg1+RPA(自噬激动剂)组，V: G-Rg1+3-MA(自噬抑制剂)组。
02人参皂苷Rg1可促进急性肝损伤动物的肝细胞自噬流式细胞术显示（图2），
人参皂苷Rg1对自噬的促进作用明显强于对照组（急性肝损伤组）。同时，自噬激动剂RPA联合人参皂苷Rg1可进一步促进自噬。自噬抑制剂3-MA加人参皂苷Rg1可使急性肝损伤动物的自噬水平低于人参皂苷Rg1治疗组，提示人参皂苷Rg1对急性肝损伤的保护作用是通过诱导自噬实现的。
图2 人参皂苷Rg1对急性肝损伤的自噬的影响A、B:对照组、G-Rg1(4mg/ml)对照组、G-Rg1(4mg/ml) + RPA(1mg/kg)组和G-Rg1(4mg/ml) + 3-MA (1mg/kg)组注射CCl4 24 h后流式细胞术检测细胞自噬情况。
03人参皂苷Rg1可抑制急性肝损伤动物的肝细胞凋亡注射CCl4 24h后，通过TUNEL染色和流式细胞术检测凋亡的肝细胞(图3)。
TUNEL染色显示（图3A），人参皂苷Rg1处理组与对照组相比，显著减少细胞凋亡，添加自噬激动剂RPA可进一步减少凋亡的肝细胞。相比之下，自噬抑制剂3-MA与人参皂苷Rg1联合处理组的肝细胞凋亡明显多于人参皂苷Rg1治疗组，这些结果与流式细胞术结果一致（图3B）。这也证实了人参皂苷Rg1通过激活自噬以减轻了CCl4诱导的肝细胞凋亡。
图3 人参皂苷Rg1对急性肝损伤动物的肝细胞凋亡的影响。A：注射CCl4后24h，用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒对对照组、G-Rg1(4mg/ml)对照组、G-Rg1(4mg/ml)+RPA(1mg/kg)组和G-Rg1(4mg/ml)+3-MA(1mg/kg)组的凋亡细胞进行染色。所有图像均在倒置荧光显微镜下获得。B：流式细胞术检测凋亡肝细胞。
04自噬和NLRP3炎症小体在调节急性肝损伤中起重要作用
本文作者评估自噬和NLRP3炎症小体是否在CCl4诱导的急性肝损伤动物中发挥重要作用。
图4A所示，与对照组相比，自噬激动剂RPA可降低ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6水平，而自噬抑制剂3-MA的ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显高于自噬激动剂RPA，这些结果表明诱导自噬改善了CCl4诱导的急性肝损伤的肝功能，抑制了炎症反应。图4B所示，NLRP3炎症小体抑制剂MCC950较对照组可降低ALT、AST、IL-1β、IL-6水平，NLRP3炎症小体激动剂ATP比NLRP3炎症小体抑制剂MCC950能提高ALT、AST、IL-1β和IL-6水平，上述研究表明NLRP3炎症小体活化加重CCl4诱导的急性肝损伤。图4 自噬和NLRP3炎症小体在CCl4诱导的急性肝损伤中的作用A：对照组、RPA组和3-MA组小鼠注射CCl4 24 h后血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β、IL-6的测定。B：对照组、MCC950组和ATP组注射CCl4 24 h后血清AST、ALT、TNF-α、IL-1β、IL-6的测定。
05人参皂苷Rg1通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路促进自噬
图5A、B所示，与对照组相比，人参皂苷Rg1治疗组可降低NF-κB、NLRP3炎症小体、Caspase 1、Caspase 3、IL-1β、IL-18的表达，升高LC3-II、PINK1、Parkin的表达。结果表明，人参皂苷Rg1激活的自噬可导致NF-κB和NLRP3炎症小体的减少，人参皂苷Rg1激发的自噬抑制与NF-κB和NLRP3炎症小体的增加有关，提示NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路可能参与了人参皂苷Rg1激活CCl4诱导的急性肝损伤的肝细胞自噬。
图5 NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路对人参皂苷Rg1调控急性肝损伤动物肝细胞自噬的影响
03 试验结论
本试验最终结果显示，人参皂苷Rg1通过诱导自噬和抑制NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路减轻急性肝损伤。本试验对人参皂苷水产应用的启示：自噬，能在能量或营养不足的情况下防止细胞损伤并对各种细胞毒性损伤做出反应，其能反映组织器官对自我损伤的修复和细胞的再生更新。在高密度胁迫、高投喂、环境变化以及毒素刺激下，水产动物的组织器官，尤其是肝脏/肝胰腺时常遭受毒性损伤，人参皂苷Rg1激活自噬减少肝细胞凋亡、诱导组织新生，可促进肝细胞稳态，对于维持长期的肝健康至关重要。